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黃曲霉毒素總量(Aflatoxin Total)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書

【概要】

黃曲霉毒素是一類真菌（主要是黃曲霉和寄生曲霉）代謝的有毒產(chǎn)物，主要存在于谷物，堅(jiān)果，棉籽以及一些與人類血液，動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃曲霉毒素以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2這四種毒素為主，黃曲霉毒素總量一般是指這四種毒素的總量。它們是I類致癌物，被證明對(duì)人和動(dòng)物的肝臟、腎臟等組織和器官具有很大的危害，是一類毒性很強(qiáng)的致癌物質(zhì)。因此，必須對(duì)其進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)監(jiān)控，目前主要的檢測(cè)手段是高效液相色譜法。（HPLC）

本產(chǎn)品是基于免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理建立的一種快速定量檢測(cè)黃曲霉總量的試劑盒。它具有簡(jiǎn)單、快速，無需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，既可以用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，也可在農(nóng)場(chǎng)、飼料混合車間等進(jìn)行實(shí)地測(cè)定。

【適用范圍】

可定性、定量檢測(cè)玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲霉毒素總量。

【試驗(yàn)原理】

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本/黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素總量抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素總量抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去，再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素總量的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素總量的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：0.1ppb

【交叉反應(yīng)率】

   結(jié)構(gòu)類似物                                                               交叉反應(yīng)率

  黃曲霉毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲霉毒素B2   ……………………………………………………………   75%

  黃曲霉毒素G1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲霉毒素G2   ……………………………………………………………   97%

  黃曲霉毒素M1  ……………………………………………………………   30%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

3. 酶標(biāo)物1瓶  …………………………………………  6ml

4. 顯色液1瓶 …………………………………………  12ml

5. 終止液1瓶  ………………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………50ml

8. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………25ml

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅氮吹儀

┅┅粉碎機(jī)

┅┅離心機(jī)

┅┅微量天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：?jiǎn)蔚?20μl～200μl、200μl～1000μl、 多道300μl

試劑：

┅┅甲醇（分析純）

┅┅石油醚

┅┅去離子水（或蒸餾水）

┅┅乙腈

┅┅NaCl

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

3. 谷物稀釋液：將0.9gNaCl用配制完成的樣品稀釋液溶解并定容至100ml。

4. 啤酒稀釋液：取無水甲醇，用配制完成的樣品稀釋液按1:4體積比進(jìn)行稀釋（1份甲醇+4份樣品稀釋液）。

5. 50%甲醇：取無水甲醇，用去離子水按1:1體積比進(jìn)行稀釋（1份無水甲醇+1份去離子水）。

【樣本前處理步驟】

一、 谷物（大米、玉米、小米等低脂含量）（稀釋倍數(shù)：8）

1. 取1.0g粉碎的樣品與8ml 谷物稀釋液混合均勻；

2. 強(qiáng)力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取上清液100μl待測(cè)。

二、 蛋糕（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4ml 50%甲醇混合均勻；

2. 強(qiáng)力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。

三、 花生、奶油蛋糕（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合均勻；

3. 強(qiáng)力振蕩3min；

4. 5000g離心10min；

5. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，充分混勻；

6. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。

四、 食用油（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1.0g樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合，振蕩1min；

3. 靜置10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。

五、 飼料、面粉、湯圓（稀釋倍數(shù)：24）

1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻；

2. 強(qiáng)力振蕩3min；

3. 2000g離心10min；

4. 取上層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。

六、 啤酒（稀釋倍數(shù)：5）

1. 取200μl啤酒樣品（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋液；

2. 振蕩3min；

3. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。

七、醬油、醋、葡萄酒（稀釋倍數(shù)：8）

1. 取0.5ml樣品，加入0.5ml蒸餾水并加入4.0ml三氯甲烷；

2. 混勻振蕩3min，5000g離心10min；

3. 取1.0ml下層液，60℃氮?dú)獯蹈桑?

4. 加入100μl乙腈溶解干燥物，并加入900μl樣品稀釋液，充分混勻；

5. 取100μl稀釋后液體待測(cè)。

【檢測(cè)步驟】

一、 測(cè)定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結(jié)果判定】

1. 百分吸光率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素總量標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素總量實(shí)際量。

【注意事項(xiàng)】

1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6. 儲(chǔ)存條件：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對(duì)光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質(zhì)的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8. 加入顯色液后，一般顯色時(shí)間為15～30min。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到35min（或更長(zhǎng)），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【樣品最低檢測(cè)限】

    谷物 ………………………………………………0.8ppb

    蛋糕 …………………………………………………1ppb

    花生、奶油蛋糕……………………………………1ppb

    食用油 ………………………………………………1ppb

    飼料、面粉、湯圓………………………………2.4ppb

    啤酒  ………………………………………………0.5ppb

    醬油、醋 …………………………………………0.8ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。